線粒體DNA能編碼13種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)都參與到細(xì)胞的能量供應(yīng)鏈中。而線粒體DNA突變可導(dǎo)致數(shù)十種至今無(wú)法治愈的代謝性疾病。開(kāi)發(fā)可以精確糾正線粒體DNA的基因編輯工具，將為治療這類(lèi)疾病打開(kāi)大門(mén)。

　　Leber遺傳性視神經(jīng)病、線粒體腦肌病、乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作綜合征、神經(jīng)性肌肉衰弱癥，以及一些先天性心臟病……這些都是因線粒體基因突變引起的常見(jiàn)遺傳疾病。目前，全球無(wú)數(shù)患者正在受著煎熬，卻沒(méi)法獲得有效治療。

　　人類(lèi)遺傳物質(zhì)除了大部分在細(xì)胞核內(nèi)，還有一小部分存在于線粒體中。現(xiàn)在科學(xué)家們已經(jīng)將基因編輯技術(shù)用于精準(zhǔn)編輯細(xì)胞核內(nèi)DNA，但如何對(duì)線粒體內(nèi)DNA進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，一直無(wú)法取得突破。

　　不久前，《自然》雜志發(fā)表了美國(guó)哈佛大學(xué)劉如謙（David Liu）團(tuán)隊(duì)發(fā)表的一項(xiàng)最新成果，不但可實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體基因組的精準(zhǔn)編輯，而且?guī)缀鯖](méi)有脫靶效應(yīng)，這為研究和治療線粒體遺傳病帶來(lái)了前所未有的希望。

　　從編輯基因序列到改變單個(gè)堿基

　　此次劉如謙團(tuán)隊(duì)的重大突破，在于解答了成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)核酸酶（CRISPR）也沒(méi)法解決的歷史遺留難題——對(duì)線粒體DNA的精準(zhǔn)編輯。

　　線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，是細(xì)胞能量生成和傳遞的主要細(xì)胞器，被稱(chēng)為“能量工廠”。除了為細(xì)胞提供能量外，線粒體還參與諸如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的能力。

　　基因編輯是一種新興的對(duì)特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于從動(dòng)物和植物的基因改造到人類(lèi)的基因治療等生命科學(xué)諸多領(lǐng)域。

　　“早期的基因工程技術(shù)只能將遺傳物質(zhì)隨機(jī)插入宿主基因組，基因編輯則能定點(diǎn)改造想要編輯的基因。”蘇州博騰生物首席技術(shù)官孔令潔博士向科技日?qǐng)?bào)記者介紹，基因編輯依賴(lài)于經(jīng)過(guò)基因工程改造的核酸酶，類(lèi)似于外科醫(yī)生的手術(shù)刀。“目前常用的基因編輯酶主要有鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)核酸酶。這些核酸酶能定點(diǎn)改造特定的DNA，對(duì)基因進(jìn)行敲除、插入或替換?！?/p>

　　除了核酸酶外，劉如謙實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的堿基編輯酶，可利用一種細(xì)菌毒素DddA，將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體基因組的精準(zhǔn)編輯，以更改基因組里的單個(gè)堿基。

　　相比于一段一段地更改基因序列的常規(guī)基因編輯，這種堿基編輯技術(shù)可以在基因組上造成單個(gè)堿基改變，把腺嘌呤（A）變成鳥(niǎo)嘌呤（G），把胞嘧啶（C）變成胸腺嘧啶（T）?！袄碚撋蠅A基編輯可以改變基因組中的任何堿基，因此大大擴(kuò)寬了基因編輯的范圍和靈活性。”孔令潔解釋說(shuō)。

　　編輯線粒體DNA面臨兩大難點(diǎn)

　　“線粒體擁有自身的遺傳物質(zhì)和遺傳體系，和細(xì)胞核DNA相比，線粒體只編碼少數(shù)的基因，但這些基因?qū)?xì)胞功能至關(guān)重要?！笨琢顫嵳f(shuō)，線粒體DNA在發(fā)生突變后，容易喪失制造三磷酸腺苷的能力，往往會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)造成損傷，引發(fā)母系遺傳的特定疾病。線粒體肌病、多系統(tǒng)疾病、心肌病、進(jìn)行性眼外肌麻痹等疾病就是這樣發(fā)生的。

　　目前治療一般是給予三磷酸腺苷、輔酶Q10和大量B族維生素等，但效果很不理想，且不能根治。線粒體基因編輯技術(shù)可能成為根治這類(lèi)疾病的有效方法。

　　盡管近幾年基因編輯有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，但是這些進(jìn)步都是在細(xì)胞核DNA上進(jìn)行的，線粒體DNA編輯一直面臨難以解決的問(wèn)題。對(duì)線粒體DNA的精準(zhǔn)編輯是從來(lái)沒(méi)人實(shí)現(xiàn)過(guò)的，現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的CRISPR技術(shù)面對(duì)線粒體DNA也是束手無(wú)策——線粒體沒(méi)有吸收RNA的機(jī)制，所以讓CRISPR技術(shù)發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分向?qū)NA（gRNA）根本無(wú)法進(jìn)入線粒體。

　　“線粒體DNA之所以難以編輯，主要原因有兩方面：一是線粒體是細(xì)胞中具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，線粒體DNA位于線粒體內(nèi)部，受到線粒體雙層膜的保護(hù)，外源的基因編輯工具很難高效進(jìn)入線粒體內(nèi)部；另一方面，線粒體DNA不同于核基因組DNA，缺乏有效的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，一旦其受到雙鏈斷裂損傷時(shí)，就會(huì)被降解，而大多數(shù)基因編輯工具是利用DNA損傷修復(fù)的原理進(jìn)行編輯，因此在線粒體DNA上很難進(jìn)行?！敝袊?guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所副研究員畢蕊博士告訴記者。

　　孔令潔也認(rèn)為，一般細(xì)胞核基因有兩個(gè)拷貝，基因編輯相對(duì)容易，而線粒體基因在一個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)依賴(lài)于核酸酶，不能編輯線粒體基因。

　　有助構(gòu)建線粒體疾病動(dòng)物模型

　　DddA是一種細(xì)菌毒素，最初由華盛頓大學(xué)的微生物學(xué)家約瑟夫·穆格團(tuán)隊(duì)中的一位博士后馬爾科斯·德莫雷斯發(fā)現(xiàn)。2018年，德莫雷斯發(fā)現(xiàn)DddA具有催化胞嘧啶脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ幕钚?。而且有意思的是，與其他的脫氨酶不同，這種作用可以直接在DNA雙螺旋上發(fā)生，不需要解旋，因而不需要gRNA。

　　DddA本身是種蛋白質(zhì)，能夠進(jìn)入線粒體，又可以直接對(duì)雙鏈DNA編輯。穆格當(dāng)時(shí)就想到了只聞其名未曾謀面的同事劉如謙——因?yàn)閯⑷缰t團(tuán)隊(duì)之前開(kāi)發(fā)的CRISPR單堿基編輯器中就有用到過(guò)脫氨酶，或許DddA也能夠在相關(guān)的領(lǐng)域得到應(yīng)用。

　　DddA對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)是有生物毒性的。為了避免這種毒性，研究人員想出的辦法是把DddA一拆兩半，變成兩個(gè)沒(méi)有活性的部分，進(jìn)行編輯后讓兩部分重組恢復(fù)脫氨活性；然后再將設(shè)計(jì)好的TALE蛋白與半個(gè)DddA相連，這樣DddA們就能夠在編輯位點(diǎn)重逢了。

　　如何讓組合好的DddA進(jìn)入線粒體，倒是不難解決。此前的一系列研究成果表明，可以利用線粒體的蛋白質(zhì)吸收機(jī)制，穿過(guò)線粒體的雙層膜。DddA作為一種胞苷脫氨酶，它能夠?qū)崿F(xiàn)胞嘧啶、尿嘧啶轉(zhuǎn)換的一系列操作。

　　為了使DddA的作用不被干擾，研究團(tuán)隊(duì)還要再加上尿嘧啶糖基化酶抑制劑，等到下一輪DNA復(fù)制，它就可以和腺嘌呤互補(bǔ)而不是和鳥(niǎo)嘌呤互補(bǔ)。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，加入抑制劑后，編輯效率提高了8倍。

　　動(dòng)物疾病模型往往是藥物研發(fā)必需的工具。在該線粒體基因編輯技術(shù)之前，由于不能對(duì)線粒體基因進(jìn)行精準(zhǔn)的改造，因而無(wú)法獲得相應(yīng)的動(dòng)物疾病模型，大大阻礙了線粒體相關(guān)疾病的藥物的研發(fā)。

　　“這一技術(shù)的應(yīng)用，將使動(dòng)物疾病模型建立成為可能，加快藥物的研發(fā)?！笨琢顫嵏嬖V記者，同時(shí)，隨著基因治療的發(fā)展，以此項(xiàng)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因治療藥物，可能成為根治線粒體疾病的有效方法。

　　“基因治療是有望治愈線粒體DNA突變導(dǎo)致的疾病的重要方法?！碑吶镎f(shuō)，隨著線粒體DNA編輯工具的發(fā)展，可以在局部病變組織中將突變的DNA修復(fù)成正常的野生型DNA，對(duì)局部組織進(jìn)行基因編輯，既可以避免直接對(duì)胚胎基因編輯帶來(lái)的倫理問(wèn)題和安全性問(wèn)題，又可以直接針對(duì)病灶組織進(jìn)行快速高效的基因治療，惠及更多患者。

　　此前，劉如謙曾對(duì)《自然》雜志表示，這項(xiàng)研究因還有其他問(wèn)題需要研究，距離應(yīng)用到臨床還有很長(zhǎng)的路要走。但短期來(lái)看，科學(xué)家們可通過(guò)利用該技術(shù)生成動(dòng)物模型，來(lái)研究線粒體突變的影響。